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生长素作为最早被发现的植物激素，通过促进细胞的伸长和分裂来影响植物不同发育时期组织和器官的分化与生长，同时通过极性运输调控植物的向性生长。植物根的向重力性是指在重力的作用下，其表现出沿着重力方向生长的特性，包括重力的感知、信号转导、生长素不对称分布和弯曲生长 4 个环节。其中，根冠的柱状细胞是感受重力信号的部位，根尖的伸长区细胞是对重力刺激作出反应的部位。生长素具有极性运输的特性，在植物体内的定向运输由输入载体 AUX1/LAX 蛋白家族、输出载体 PIN 家族和 p-glycoprotein（PGP）家族共同调控。研究表明，根受到重力方向改变的刺激后，生长素在 AUX1、PIN3 和 PIN2 载体介导下，使根尖伸长区近地侧和远地侧细胞的生长素浓度出现差异，进而导致伸长区两侧细胞的生长速率不同，造成根尖向新的重力方向弯曲生长。拟南芥在重力方向改变的刺激下，根尖向新的重力方向弯曲，且随着时间的推移，弯曲的角度愈加明显，学生可以通过观察重力方向改变刺激下不同时间节点的拟南芥幼苗根尖弯曲的角度，理解根向重力生长的现象。 

生长素在植物营养生长和生殖生长过程中均发挥着重要作用，其在植物组织的不均匀分布，会引起植物体不同的生长变化，故而理解生长素在组织和细胞间的分布对于阐明生长素调控拟南芥根向重力生长的生理机制至关重要。生长素报告基因 DR5 由 7 个生长素应答元件组成，这些元件是生长素应答转录因子（auxin response factors，ARF）的结合位点。在 DR5 控制下表达适当的荧光蛋白，能够可视化生长素在植物组织中的积累与分布。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）在紫外线照射下能够被激发，发出绿色荧光，因此可以通过 DR5rev：GFP 来指示拟南芥体内生长素的响应水平和变化趋势。带有核定位序列的DR5：3xVenus 也可以清晰地反映植物体内生长素的响应。此外，β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）被广泛用作报告基因，对 DR5：GUS 转基因拟南芥幼苗进行重力方向改变处理后，通过 GUS 染色，在显微镜下可以观察和比较植物根尖生长素的变化。在重力方向改变刺 激下引起的根尖两侧生长素不对称分布主要由生长素运输载体 AUX1 和 PIN2 介导，aux1-T 和 pin2-T 突变体表现出向重力生长异常。学生可以通过比较重力方向改变刺激下野生型和突变体拟南芥幼苗根尖的表型，测量并统计根尖的弯曲角度，进一步理解生长素调控植物根向重力生长的生理机制。

该实验不仅能够填补植物激素实验教学中“生长素调控根向性生长”部分内容的空白，还能进一步加深学生对生长素极性运输的理解和认识。此外，还可以帮助学生熟悉显微镜的操作和使用。 

此实验教学的重点在于帮助学生学习和理解在重力方向改变的刺激下，生长素如何依赖运输载体在根尖形成不对称分布，从而使根尖沿着新的重力方向生长。而教学难点在于利用荧光显微镜观察生长素报告基因 DR5rev：GFP 与 DR5：3xVenus 的表达 ，以 及相关突变体向性实验的观察与测量。 

本实验可以分为 4 个部分进行：1）重力处理 0、12 和 24 h 后分别观察拟南芥幼苗根尖弯曲情况并拍照（4 个学时）。2）在激光共聚焦显微镜下观察重力刺激前 、后 DR5rev：GFP 和 DR5：3xVenus 转基因拟南芥根尖的荧光信号（8 个学时）。3）将重力刺激前、后的 DR5：GUS 转基因拟南芥幼苗分别放入含有 GUS 染液的 12 孔板， 观察其根尖处 GUS 染色情况（4 个学时）。4）观察拟南芥野生型和突变体在重力刺激下根尖的弯曲情况，并统计根尖的弯曲角度（8 个学时）。 

种植与培养工作由教师提前完成。在超净工作台中分别用 70% 乙醇和 1% 次氯酸钠处理拟南芥种子 5、10 min 进行表面消毒，然后用无菌水清洗 4~5 次 后保存于 1.5 mL 离心管中，在 4℃冰箱内放置 2~3 d 后，在超净工作台中将种子整齐播种在 MS 固体培养基上（播种密度不宜过大），培养皿用封口膜密封后垂直放置于培养条件为 16 h 光照/ 8 h 黑暗、光照强度为 100 μmol·m-2 ·s -1 、温度为 （22±1）℃的培养箱中。 

1）GUS染色液：0.5 mg /mL 的 X-Gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛 酸），0.1% 的 Triton X-100，0.5 mmol/L 的 氰 铁 酸 盐 ，50 mmol/L 的 磷 酸 缓 冲 液（pH=7.0），其中 XGluc 需事先溶解在二甲基甲酰胺（DMF）中再用于染液配制。2）卡诺固定液按无水乙醇∶冰醋酸=3∶1 的体积比配制。3）透明液按水合氯醛∶ 无菌水∶甘油=8∶3∶1 的体积比配制。

将 16 h 光照/8 h 黑暗条件下生长 3 d 的拟南芥幼苗进行遮光处理（避免向光性干扰），继续垂直培养 1 d 后，将培养皿旋转 90°进行改变重力方向处理。分别在重力方向改变 0、12 和 24 h 后用体视显微镜进行观察并拍照。观察和比较重力方向改变刺激下，不同时间节点的拟南芥幼苗根尖的弯曲情况。 

将竖直培养 3 d 的 DR5rev：GFP 和 DR5：3xVenus 转基因拟南芥幼苗进行遮光处理，继续垂直培养 1 d 后，将培养皿旋转 90°进行重力方向改变处理。用镊子分别挑取改变重力方向处理 0、6 h 时的 DR5rev：GFP 和 DR5：3xVenus 转基因幼苗，将其根部置于载玻片上，滴加 8% 的甘油使根部浸没在甘油溶液中，轻轻盖上盖玻片。在紫外激发光的照射下观察并拍照。为了便于观察根的整体轮廓，可以用 1 mg/mL 的 PI（propidium iodide碘化丙啶）进行染色，激发和发射波长分别为 561 nm，578~ 718 nm。 

将竖直培养 3 d 的 DR5:GUS 转基因拟南芥幼苗进行遮光处理， 继续垂直培养 1 d 后，将培养皿旋转 90°进行重力方向改变处理。用镊子分别挑取处理 0、24 h 的 DR5：GUS 转基因幼苗放入 12 孔板中，加入 GUS 染色液（染色液需完全浸没材料），用锡箔纸包好后，37℃孵育 24 h，然后在卡诺固定液中固定 3 h，清水冲洗 2~3 次后加入透明剂。透明 1 d 后置于显微镜下进行观察和拍照。 

将 16 h 光照/8 h 黑暗条件下生长 3 d 的 Col-0、aux1-T 和 pin2-T 拟南芥幼苗进行遮光处理，继续垂直培养 1 d 后，将培养皿旋转 90°， 保持遮光再继续培养 24 h。使用相机或扫描仪获取图片，借助 Image J 软件测量每个幼苗根尖偏离新重力方向的角度 。利 用 Excel 和 Adobe Illustrator 软件绘制出根向重力性时钟图，以 30° 为一个区间单位，将钟表样式的圆盘从-180°~ 180°分为 12 个区间，再根据每个区间根数占所测总根数的百分比绘制钟表图。

在重力方向改变的刺激下，拟南芥根尖的生长素向近地侧伸长区的运输增强而向远地侧的运输减弱，使近地侧生长素浓度大于远地侧。近地侧生长素浓度较高，抑制了细胞的伸长，导致近地和远地两侧细胞生长速率不同，表现出根尖向重力弯曲生长的现象。可以观察到培养3 d并遮光处理 1 d 的拟南芥幼苗旋转 90°后 ， 根尖弯曲并呈现出向重力生长的现象，随着刺激时间的延长，向重力方向弯曲生长更加明显 （图 1，本文附图见封三）。 

为了进一步理解生长素调控根向重力生长的机制，借助 DR5rev：GFP、DR5：3xVenus 和 DR5：GUS 分子标记观察拟南芥根尖的生长素信号分布。这些分子标记能够清晰地反映出植物体内生长素的浓度与分布。利用激光共聚焦显微镜可以观察拟南芥 DR5rev：GFP 转基因株系在根尖的表达情况。在无重力方向改变刺激时，根尖的根冠、静止中心和中柱细胞中能够检测到 GFP 的荧光信号，而在根尖左右两侧的侧根冠细胞中没有明显的荧光信号，说明在根尖竖直生长过程中，生长素在根尖的侧根冠细胞中不积累。在重力方向改变的刺激下，根尖近地侧的侧根冠细胞中检测到 GFP 信号，而远地侧的侧根冠细胞中没有检测到 GFP 信号，这反映了在重力改变刺激下，根尖两侧的生长素分布是不对称的（图 2-a）。DR5：3xVenus 携带核定位信号，故在根部细胞中呈现点状分布。同样，0 h 时在根冠和中柱等部位可以检测到 Venus 蛋白的表达。而重力方向改变刺激 6 h 后，能够明显观察到根尖近地侧的侧根冠细胞中点状荧光信号积累较多，即生长素在根尖近地侧比远地侧积累多，同样反映了在重力的作用下生长素的不均匀分布 （图 2-b）。在未经处理的 DR5:GUS 转基因拟南芥幼苗根尖中，可以在根冠及静止中心观察到 GUS 信号；在重力方向改变刺激后，在静止中心 处观察到 GUS 信号的同时，在近地侧的侧根冠细胞中也观察到了 GUS 信号，同样表明生长素的不均匀分布（图 3）。

生长素的极性运输依赖于其运输载体 AUX1/LAX 和 PIN 蛋白。PIN 蛋白在细胞膜上的极性定位决定了生长素的极性流向，PIN2 主要在植物根向重力生长中起作用。为直观理解运输载体在根向重力生长过程中的重要作用，本实验对拟南芥 aux1-T 和 pin2-T 突变体进行了重力方向改变刺激。野生型幼苗对重力方向改变刺激作出了明显反应，而突变体的根失去了向重力反应 。通过绘制根向重力性时钟图，可以直观地观察到突变体的根向不同的方向弯曲（图 4）。

根的向重力生长是植物对重力刺激所作出的生长反应，是决定植物根系空间生长趋势的主要因素和适应生存环境的重要响应机制，这种特性与植物体内生长素浓度差的建立密切相关。生长素作为促进植物生长发育的重要激素，在其运输载体 AUX1 和 PIN2 的作用下调控根的向性生长。随着现代生物学的快速发展，生长素调控根向重力性这一生理机制被不断探究和完善，为本实验教学提供了较强的理论知识支撑。本实验不仅可以帮助学生学习植物根的特性，还能进一步加深学生对生长素乃至植物激素的认识，提升学生科学思维和探究能力。

1）对低年级学生，前期的植株培养、仪器操作、材料准备、试剂的配制和制片等可由教师完成。学生需要掌握生长素调控根向重力性的实验原理并完成显微观察。 

2）对高年级学生，以“综合性实验”完成此实验课程，可以让学生 3~4 人为一组展开实验，前期的拟南芥培养由教师完成、后期的重力处理、试剂配制、染色和制片等过程由小组成员合作完成。 

本实验方案经过反复验证，步骤操作简单，材料易于获得，结果真实可靠。实验涉及的技术包括表型观察、 转基因株系的荧光显微镜观察、GUS 染色和拟南芥根尖弯曲的角度测量。一些学校已经开展了上述部分实验技术课程，并具备了设立本实验课程的技术和设备条件。本实验设置于植物激素章节能够帮助学生更好地理解生长素的特性，同时可以让学生更好地理解生长素通过极性运输调控植物根系向重力生长的生理机制。

1）实验条件。具备植物培养箱以提供植物正常的生长条件，具备激光共聚焦显微镜或正置荧光显微镜。 

2）对教师的要求。指导教师应对生长素有清晰的认识，并熟练掌握溶液的配制、GUS 染色技术和显微镜操作技术等，并在实验开始前对学生进行理论指导以及实验操作规范的讲解。 

3）相关应用。可在已开设植物激素特性或生理观察等相关实验的学校推广应用。